¡Bienvenidos a un nuevo capítulo en nuestro viaje hacia una vida naturalmente saludable! Exploraremos un tesoro de la naturaleza que ha demostrado ser un aliado poderoso en la lucha contra el neuroblastoma: el extracto de hojas de olivo Olife.
En este fascinante recorrido, descubriremos cómo este extracto no solo detiene la proliferación celular, sino que también despierta el proceso natural de apoptosis, ofreciendo una prometedora perspectiva en la búsqueda de soluciones antitumorales.
Datos Estudio
El extracto de hojas de olivo tiene efectos antitumorales contra el neuroblastoma mediante la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis.
Fabio Morandi (1) Verónica Bensa (2) Enzo Colarco (2) Fabio Pastorino (2) Patrizia Perri (2) Maria Valeria Corrias (2) Mirco Ponzini (2) Chiara Brignole (2)
1.Laboratorio de células madre y centro de terapia celular, IRCCS Istituto Giannina Gaslini, 16147 Génova, Italia
2.Laboratorio de Terapias Experimentales en Oncología, IRCCS Istituto Giannina Gaslini, 16147 Genova, Italia
* Autor a quien debe dirigirse la correspondencia.
† Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
Nutrientes 2021, 13 (7), 2178; https://doi.org/10.3390/nu13072178
Recibido: 10 de junio de 2021 / Aceptado: 21 de junio de 2021 / Publicado: 24 de junio de 2021
Abstracto.
El estudio examina los efectos antitumorales del extracto de hojas de olivo en el neuroblastoma, revelando su capacidad para inhibir la proliferación celular y favorecer la apoptosis en células de neuroblastoma humano. Además, se observa una inhibición de la migración celular y la angiogénesis en células endoteliales cerebrales murinas. Estos resultados sugieren que el extracto de hojas de olivo podría ser considerado como un posible agente terapéutico para el tratamiento del neuroblastoma.
Introducción
Este estudio examina los efectos antitumorales del extracto de hojas de olivo (OLE) en el neuroblastoma (NB). Se evaluaron la viabilidad celular, la proliferación, el ciclo celular, la apoptosis y la migración celular en células de NB humano y células endoteliales cerebrales murinas tratadas con OLE. Los resultados indican que OLE inhibe la proliferación y promueve la apoptosis en células de NB humano, así como la migración celular y la angiogénesis en células endoteliales cerebrales murinas. La eficacia antitumoral de la quimioterapia topotecán mejora significativamente cuando se combina con OLE. En conclusión, se sugiere que OLE podría ser un agente terapéutico potencial para el tratamiento del NB.
Materiales y métodos
En la sección de Materiales y Métodos, se utilizaron diversas líneas celulares, incluyendo células de neuroblastoma humano (HTLA-230, IMR-32, SH-SY5Y, y SK-N-AS), queratinocitos humanos (HA-CAT), y células endoteliales de cerebro murino. Estas células se cultivaron en medios específicos y se caracterizaron mediante análisis periódicos de morfología y proliferación celular, así como autenticación mediante perfiles genéticos. Se empleó un extracto acuoso de hoja de olivo (OLE) en el estudio, que contenía oleuropeína, hidroxitirosol, tirosol, ácido elenólico y rutina, con concentraciones especificadas en la Tabla 1.
En la sección de Materiales y Métodos, se detallan los procedimientos utilizados para evaluar diversos aspectos de los efectos del extracto de hojas de olivo (OLE) en líneas celulares de neuroblastoma (NB). Se empleó el ensayo CFSE para medir la proliferación celular, el ensayo de anexina-V para evaluar la apoptosis, y el ensayo de viabilidad celular MTS en cultivo 2D para determinar la citotoxicidad. Además, se realizó un análisis del ciclo celular y se investigaron las vías de señalización y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Se llevaron a cabo pruebas preliminares de migración celular y se utilizaron estadísticas para analizar los resultados, repitiendo los experimentos al menos tres veces para asegurar la consistencia.
Resultados
En los resultados, se observa que el extracto de hoja de olivo (OLE) exhibe efectos citotóxicos en diversas líneas celulares de neuroblastoma (NB) humanas. La sensibilidad al tratamiento con OLE varía entre las células analizadas, siendo las células IMR-32 y HTLA-230 más afectadas incluso a dosis bajas, mientras que las concentraciones más altas de OLE son necesarias para impactar significativamente en la viabilidad celular de SH-SY5Y y SK-N-AS.
La Figura 1 presenta los efectos dosis-dependientes del tratamiento con extracto de hoja de olivo (OLE) en la viabilidad celular de las células de neuroblastoma (NB), según los ensayos MTS realizados después de 120 horas de tratamiento. Se registró la densidad óptica (OD) a 490 nm utilizando un lector de microplacas TECAN, Infinite 200. Los resultados, expresados como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, muestran una disminución significativa en la viabilidad celular con las concentraciones crecientes de OLE (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el control).
Además, se llevó a cabo un experimento a lo largo del tiempo, centrándose en las dos dosis más efectivas (200 y 300 μM). La Figura 2 indica que la viabilidad celular de las líneas IMR-32 y HTLA-230 fue más afectada por el tratamiento con OLE en comparación con SH-SY5Y y SK-N-AS, mostrando una dependencia temporal en la respuesta de las células NB a OLE.
La Figura 2 presenta los efectos dependientes del tiempo del tratamiento con extracto de hoja de olivo (OLE) en la viabilidad celular de las células de neuroblastoma (NB), evaluados mediante ensayos MTS realizados a intervalos de 48, 72, 96 y 120 horas. Los resultados, expresados como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, muestran una disminución significativa en la viabilidad celular con el aumento del tiempo de exposición a OLE (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el control).
Se llevaron a cabo experimentos en líneas celulares sanas (extremo B y HA-CAT), revelando que solo la dosis de 300 μM de OLE resultó en una reducción moderada de la viabilidad celular en una de cada dos líneas celulares de control analizadas después de una exposición prolongada (120 h; Figura complementaria S1).
Considerando la posible limitación del uso in vivo de OLE en concentraciones μM para el tratamiento de la enfermedad de NB, se realizaron experimentos de tratamiento breve. La Figura complementaria S2A, B muestra que la exposición al tratamiento corto fue casi ineficaz contra las células de control sanas, mientras que las células NB expuestas durante 18 horas a OLE experimentaron una reducción significativa de la viabilidad celular dependiente de la dosis.
Además, se llevaron a cabo experimentos en un sistema de cultivo 3D, que simula las características de los tumores sólidos. La Figura 3 ilustra los resultados de experimentos citotóxicos en esferoides tumorales IMR-32 y SH-SY5Y, donde OLE mantuvo su capacidad para reducir significativamente la viabilidad celular de los esferoides de NB de manera dependiente de la dosis y el tiempo en las dosis principalmente efectivas (200 y 300 μM).
La Figura 3 presenta los efectos dependientes de la dosis y el tiempo del tratamiento con extracto de hoja de olivo (OLE) en la viabilidad de los esferoides de neuroblastoma (NB). En la subfigura A, se muestra la viabilidad celular medida en momentos específicos mediante el ensayo 3D CellTiter-Glo®, expresada como unidad de luminiscencia relativa (RLU). Los resultados, representados como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, indican una disminución significativa en la viabilidad celular con dosis y tiempo de exposición a OLE (* p < 0,05, *** p < 0,001 en comparación con el control). En la subfigura B, se presentan imágenes representativas de microscopía de contraste de fase de esferoides tomadas a las 120 horas después del tratamiento con OLE, con una barra de escala de 100 μm.
En la sección 3.2, se destaca que el tratamiento de líneas celulares de neuroblastoma con dosis crecientes de OLE durante 72 horas resultó en una reducción de la proliferación celular dependiente de la dosis, según el ensayo CFSE (Figura 4A). Este efecto fue más pronunciado con 200 y 300 μM de OLE y afectó principalmente a las células IMR-32 y HTLA-230 en comparación con las células SH-SY5Y y SK-N-AS. Además, se investigó la progresión del ciclo celular en las líneas celulares IMR-32 y HTLA-230, revelando una detención del ciclo celular en la fase G0/G1 después de 72 horas de tratamiento con 200 y 300 μM de OLE (Figura 4B). Esta detención estuvo acompañada por la disminución de las fases S y G2/M, y el aumento significativo de células en la fase sub-G0, indicando apoptosis. Además, la detención del ciclo G0/G1 se asoció con la regulación positiva dependiente de la dosis de las proteínas p53 y ciclina-D1 de tipo salvaje (Figura complementaria S3A, B).
La Figura 4 destaca la inhibición de la proliferación celular, mediada por una detención del ciclo celular en la fase G0/G1, inducida por el tratamiento con extracto de hoja de olivo (OLE). En la subfigura A, se utilizó citometría de flujo (FCM) para registrar la intensidad de fluorescencia verde del éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), indicando una menor proliferación a medida que aumenta la fluorescencia. Los resultados, representados en recuadros de experimentos representativos de FCM, muestran una reducción dependiente de la dosis de la proliferación celular. En la subfigura B, se presenta la progresión del ciclo celular en las líneas celulares IMR-32 y HTLA-230, analizada por FCM, indicando una detención del ciclo celular G0/G1, disminución de las fases S y G2/M, y un aumento significativo de células en la fase sub-G0. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el control). CTR: control; OLE: extracto de hoja de olivo; uM: micromolar; MFI: intensidad media de fluorescencia.
En la sección 3.3, se indica que OLE induce la apoptosis de las células de neuroblastoma (NB). Los experimentos muestran que las células tratadas con OLE experimentaron apoptosis dependiente de la dosis, como se evidencia por un aumento significativo de células Anx-V+ en las dosis más altas de OLE. Además, el tratamiento con OLE activó de manera dependiente de la dosis las caspasas ejecutoras 3 y 7 en todas las líneas celulares de NB analizadas. La muerte celular apoptótica inducida por OLE se rescató mediante el pretratamiento con el inhibidor de pancaspasas Q-VD-OPh. Se exploraron vías de señalización asociadas, y se observó la participación de la vía extrínseca mediante la expresión de caspasa 8 escindida y la posible activación de la vía intrínseca a través de la regulación positiva de fosfo-Bcl-2, especialmente con la dosis más alta de OLE. La producción aumentada de especies reactivas de oxígeno (ROS) en respuesta a OLE también podría contribuir a la activación de la vía intrínseca.
La Figura 5 muestra la inducción dependiente de la dosis de apoptosis en células de neuroblastoma (NB) después del tratamiento con extracto de hoja de olivo (OLE). En la subfigura A, se observa un aumento significativo de células Anx-V+ determinadas por citometría de flujo (FCM). En las subfiguras B y C, se evalúan los niveles de expresión de las proteínas de las caspasas ejecutoras 3 y 7, respectivamente, también por FCM. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el control). OLE: extracto de hoja de olivo; CTR: control; uM: micromolar; MRFI: relación media de intensidad de fluorescencia.
En la sección 3.4, se indica que OLE activa la vía NF-kB. Los niveles de expresión de fosfo-NF-kB aumentaron con el tratamiento de OLE, mientras que la forma nativa de NF-kB permaneció inalterada.
En la sección 3.5, se destaca que OLE inhibe la migración de las células NB IMR-32 y SH-SY5Y. El ensayo de rayado muestra que, después del tratamiento con OLE, estas células no logran cerrar completamente la herida en comparación con las células de control no tratadas durante un período de 48 horas. El análisis de regresión lineal indica diferencias significativas en las pendientes de cierre de heridas entre las células tratadas con OLE y las no tratadas, y el ancho de la herida en las células tratadas con OLE es significativamente mayor a las 24, 36 y 48 horas.
La Figura 6 muestra los efectos de OLE sobre la migración de células de neuroblastoma (NB). Las curvas de cierre de heridas (A y E) indican que las células tratadas con OLE (extracto de hoja de olivo) en comparación con el control (CTR) de las líneas IMR-32 y SH-SY5Y no logran cerrar completamente la herida. Las diferencias en el ancho de la herida (B-D y F-H) revelan que, a lo largo del tiempo, las células tratadas con OLE tienen un ancho de herida significativamente mayor en comparación con el control. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el control). OLE: extracto de hoja de olivo; CTR: control; uM: micromolar; µm: micrómetro; h: horas.
En la sección 3.6, se explora la sinergia de OLE con topotecán (TOPO) contra las células NB. Se realizaron experimentos combinando dosis crecientes de OLE y TOPO, evaluando la sinergia mediante el índice de combinación (IC). La administración combinada de OLE y TOPO a células IMR-32 durante 96 horas produjo efectos sinérgicos generalizados, con rangos de IC que indican sinergismo o sinergismo moderado. Además, la mejor combinación (OLE 200 μM + TOPO 10 nM) se probó frente a esferoides de la línea celular IMR-32, confirmando la reducción significativa de la viabilidad celular en comparación con cada fármaco utilizado solo.
La Figura 7 presenta los efectos de la combinación de extracto de hoja de olivo (OLE) y topotecán (TOPO) sobre la viabilidad celular de las líneas IMR-32 y SH-SY5Y. El ensayo MTS muestra los efectos de los fármacos individuales (A) y la combinación de fármacos (B). La tabla (C) muestra los valores del índice de combinación (CI) para diferentes combinaciones de OLE y TOPO, indicando sinergismo (CI < 1), antagonismo (CI > 1) o adicción (CI = 1). El ensayo de viabilidad (D) destaca los efectos de OLE y TOPO, tanto como fármacos individuales como en combinación, en esferoides tumorales de la línea IMR-32. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). CTR: control; OLE: extracto de hoja de olivo; TOPO: topotecán; uM: micromolar; nM: nanomolar; OD: densidad óptica; RLU: unidad de luminiscencia relativa.
Discusión
Este estudio investiga los efectos antitumorales del extracto de hoja de olivo (OLE) en células de neuroblastoma (NB), abordando la viabilidad celular, proliferación, ciclo celular, apoptosis y migración in vitro. Aunque un informe previo examinó la eficacia antitumoral de la oleuropeína (un componente de OLE) contra NB, este estudio se centra en el extracto completo de hoja de olivo. OLE, con su variedad de compuestos fenólicos, ha demostrado propiedades antitumorales en diversos modelos.
*Los resultados indican que OLE reduce la viabilidad celular de las líneas NB de manera dependiente del tiempo y la dosis. Se observa una detención del ciclo celular en fase G0/G1 y una inducción de apoptosis, acompañada por la activación de caspasas. Además, OLE activa la vía NF-kB y muestra efectos inhibidores en la migración celular. Los experimentos en esferoides tumorales confirman la eficacia de OLE en un entorno más relevante para los tumores sólidos.
*El estudio destaca la seguridad de OLE para células sanas y sugiere su potencial como adyuvante en terapias combinadas. La combinación de OLE y topotecán muestra efectos sinérgicos en la viabilidad celular de las líneas NB, respaldando la idea de que OLE podría mejorar la respuesta a la quimioterapia convencional.
Conclusiones
En resumen, los resultados in vitro de este estudio sugieren la necesidad de investigaciones preclínicas adicionales antes de considerar la aplicación clínica de OLE. Existe la posibilidad de que, en combinación con tratamientos estándar, el uso de OLE pueda mejorar los resultados clínicos en pacientes con neuroblastoma de alto riesgo.
Materiales complementarios
Materiales complementarios disponibles en línea en el enlace proporcionado. Estos materiales incluyen varias figuras (S1 a S9) que muestran los efectos de la exposición al tratamiento con OLE (extracto de hoja de olivo) en la viabilidad celular y la regulación de diversas proteínas en células sanas y en células NB (neuroblastoma).
Las figuras abordan temas como la viabilidad celular, la regulación de proteínas como p-53 y ciclina-D1, la inducción de apoptosis, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la regulación de NF-kB, y la inhibición de la migración celular en líneas celulares IMR-32 y SH-SY5Y. Además, se destaca el rescate de la muerte celular apoptótica mediante pretratamiento con el inhibidor de pan caspasas Q-VD-OPh.
Contribuciones de autor
Conceptualización: FM, FP, MP, CB; Metodología: VB y EC; Investigación: VB, FM y CB; Redacción: preparación del borrador original: CB; Redacción: revisión y edición: FM, FP, MP, MVC y PP Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Fondos
El estudio fue apoyado por subvenciones de la Associazione Italiana per la Ricerca sulCancro (AIRC): Investigator Grant n. 18474 al MP y n. 24397 a FP y Ministero della Salute, Ricerca Corrente 2021 al Istituto Giannina Gaslini.
Declaración de la Junta de Revisión Institucional
No aplica.
Declaración de consentimiento informado
No aplica.
Declaración de disponibilidad de datos
No aplica.
Expresiones de gratitud
VB y EC recibieron una beca ONLUS de la Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma y la Associazione Oncologia Pediátrica E Neuroblastoma (OPEN).
Agradecemos a Torrisi C. por facilitarnos el Extracto de Hoja de Olivo (OLIVUM, EvergreenLife). Agradecemos a BioRender.com ( https://biorender.com/ ; fecha de acceso: marzo-junio de 2021) que se ha utilizado para crear el resumen gráfico.
Referencias
Pueden encontrar todas las referencias desde MDPI
Estilo MDPI y ACS
Morandi, F.; Bensa, V.; Calarco, E.; Pastorino, F.; Perri, P.; Corrías, MV; Ponzoni, M.; Brignole, C. El extracto de hojas de olivo tiene efectos antitumorales contra el neuroblastoma mediante la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis. Nutrientes 2021 , 13 , 2178. https://doi.org/10.3390/nu13072178
Estilo AMA
Morandi F, Bensa V, Calarco E, Pastorino F, Perri P, Corrias MV, Ponzoni M, Brignole C. El extracto de hojas de olivo tiene efectos antitumorales contra el neuroblastoma mediante la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis. Nutrientes . 2021; 13(7):2178. https://doi.org/10.3390/nu13072178
Estilo Chicago/Turabiano
Morandi, Fabio, Verónica Bensa, Enzo Calarco, Fabio Pastorino, Patrizia Perri, María Valeria Corrias, Mirco Ponzoni y Chiara Brignole. 2021. “El extracto de hojas de olivo tiene efectos antitumorales contra el neuroblastoma mediante la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis” Nutrients 13, no. 7: 2178. https://doi.org/10.3390/nu13072178
“Con cada sorbo de Olife, abrazamos la esperanza que brota de las hojas de olivo, revelando un camino prometedor hacia la lucha contra el neuroblastoma. En cada gota, se destila el poder de la investigación, demostrando que en la naturaleza encontramos aliados contra el cáncer. ¡Que tu día esté impregnado de la fortaleza de Olife y la certeza de un futuro lleno de posibilidades!”
Anif García
Mentor-Coach de Bien&Estar
Te acompaño a emprender una vida Natural&Mente
Cuídate Natural&Mente
www.vidanaturalmente.com/cuidate-en-natural/
Referencias MDPI
Foto de portada de Pixabay
